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                      检测原理

                      实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,FQ-PCR,简称Real-time PCR)技术是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针,对PCR产物进行实时检测,随着PCR反应的进行,PCR反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增 加。每经过一个循环,收集一次荧光信号,通过荧光强度变化监测产物量的变化,结合相应的软件可以对产物进行分析,从而得到一条荧光扩增曲线,从而推算出待 测样品的初始模板。荧光定量PCR技术实现了PCR从定性到定量的飞跃,以高特异性、高灵敏性、高重复性、速度快、闭管反应等优点成为分子生物学研究中的 极其重要的工具。Ct值是循环阈值(cycle threshold value)的简称,即PCR扩增过程中扩增产物荧光信号达到设定的荧光阈值时所经过的扩增循环数。定量原理就是依据初始模板量的对数值与循环数Ct值成 线性关系。

                      检测流程:

                      1.根据客户提供的基因信息,评估服务可行性

                      2.Real-time PCR预实验

                      3.样本DNA/RNA提取

                      4.RNA逆转录为cDNA

                      5.引物/探针设计和引物合成及优化

                      6.内参引物设计(如GAPDH、β-actin、β-tubulin等)

                      7.样本DNA/cDNA的检测(单个样本重复3次,每次3个重复孔)

                      8.数据处理与统计

                      9.提供实验原始数据及分析报告

                      检测方法

                      SYBR? Green I嵌合荧光法,双标记荧光探针法

                      检测仪器:ABI公司StepOne Plus荧光定量PCR仪和ABI 7300型荧光定量PCR仪

                      样品要求

                      1.进行mRNA表达量分析时,请寄送足量的并且保证纯度的Total RNA (浓度在500 ng/μl以上,体积在 20μl以上)。如果目的基因表达量低时,应尽量提供更高浓度的Total RNA。

                      2.如果提供的材料为细胞或组织,DNA、RNA的提取费用另收。 同时应保证材料新鲜,动物细胞数为106以上,动物组织为100 mg以上。

                      试验周期

                      样本检测合格后,根据样本多少,2-8周不等。若遇特殊原因,如因实验材料原因,Total RNA需要重新提取等情况,交货期会有所延长。

                      结果输出

                      提供完整实验流程报告及数据分析和扩增图谱等

                       

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